課題番号 ：S-18-KU-0064
利用形態 ：共同研究
利用課題名（日本語） ：ヒドロキシメチルビラン合成酵素の酵素-基質複合体の単離同定
Program Title (English) ：Isolation and identification of enzyme-substrate complexes of hydroxymethylbilane synthase
利用者名（日本語） ：佐藤秀明
Username (English) ：Hideaki Sato
所属名（日本語） ：久留米大学医学部
Affiliation (English) ：Kurume University School of Medicine

１．概要（Summary）
　ヘム生合成に関わるヒドロキシメチルビラン合成酵素（HMBS）はジピロメタン補因子をもち，ポルホビリノーゲン（PBG）を4分子連結して鎖状テトラピロールのヒドロキシメチルビランを合成する。この反応過程の詳細を構造面から解明するため，基質結合数が異なる酵素-基質複合体をカラムクロマトグラフィーにより単離し，質量分析により同定した。

２．実験（Experimental）
　まず大腸菌で発現させたヒトHMBSを各種のカラムクロマトグラフィーによって精製し，補因子の結合したホロ型HMBSを単離した。これに数等量の基質PBGを添加して，反応途中のHMBS-基質複合体をHPLCで分画した。それぞれの画分について酵素-基質複合体の構成情報を得るため，質量分析装置CSI-MS（JEOL社製 JMS-T100CS）により分析した。

３．結果と考察（Results and Discussion）
　HPLCでは，添加した基質の等量数に応じて複数のピークの出現が観測された。各ピークを分取して質量分析を行うと，基質が1〜4個結合した酵素-基質複合体に対応する多価イオンピークがそれぞれ観測された。特に，以前の結晶構造解析で酵素に基質が2分子結合したES2複合体が観察されたピークについて，今回の質量分析では基質が3分子結合したES3複合体に相当する多価イオンピークを示すことが再確認された。この結果から，ES3複合体は少なくとも試料調製の段階までは存在しているが，不安定なために結晶化あるいは構造解析の過程で基質1分子が解離してES2複合体になっている，あるいはES3複合体で存在はしているが結晶構造解析では構造のゆらぎのためにピロール鎖末端の基質1個分が観察できていないことが考えられる。

４．その他・特記事項（Others）
　共同研究者：久枝 良雄 教授，増子 隆博 技官
　本研究は，JSPS科研費18K05326の助成を受けて実施された。

５．論文・学会発表（Publication/Presentation）
(1)佐藤秀明，杉島正一，塚口 舞，増子隆博，小俣義明，和田 啓，久枝良雄，山本 健，日本化学会第99春季年会，平成31年3月17日．
(2)佐藤秀明，杉島正一，塚口 舞，増子隆博，小俣義明，和田 啓，久枝良雄，山本 健，第19回日本蛋白質科学会年会 第71回日本細胞生物学会大会 合同年次大会, 　令和元年6月24,25日．
(3)佐藤秀明，第92回日本生化学会大会，令和元年9月18日．

６．関連特許（Patent）
　なし。