課題番号 ：S-19-NM-0046
利用形態 ：機器利用
利用課題名（日本語） ：三次元細胞シート組織内血管網様構造の構築
Program Title (English) ：Construction of microvasculatures within three dimensional cell sheet-based tissue
利用者名（日本語） ：白木義基1)、長瀬健一1) 、小林純2)
Username (English) ：Y. Shiraki1), K. Nagase1), J.Kobayashi
所属名（日本語） ：1) 慶應義塾大学 薬学部、東京女子医科大学 先端生命医科学研究所
Affiliation (English) ：1) Faculty of Phramacy, Keio University, 2) Institute of Advanced Biomedical Engineering
and Science, Tokyo Women’s Medical University

１．概要（Summary）
本研究は、創薬への応用が期待される心臓や肝臓などの細胞から成る、毛細血管網を有する3次元(3D)細胞シート組織モデルの構築を目的とする。その予備検討として、種々のヒト培養細胞の血管新生因子分泌能を評価し、細胞シート組織モデルとして最適な細胞株を選定する。そのために、抗体アレイを用いて3種類のヒト培養細胞 (293FT細胞、HeLa細胞、HEK293細胞)培地中の血管新生因子を定量した。

２．実験（Experimental）
【利用した主な装置】
 レーザースキャナーSureScan 4900DA
【実験方法】
293FT細胞、HeLa細胞、HEK293細胞を24 wellプレートに6.0×104 cells/cm2で播種し、ウシ胎児血清10%を含む培地中、37°C、5% CO2濃度で24時間培養後、採取した培地200 µLを-30℃で保存した。抗体アレイQuantibody® Human Angiogenesis Array 1を用いて、培地中の10項目の血管新生因子 (angiogenin, Angiopoietin-2 (ANG-2), Epidermal Growth Factor (EGF), Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF), Heparin-binding EGF-like Growth Factor (HB-EGF), Hepatocyte Growth Factor (HGF), Leptin, Platelet-derived Growth Factor-bb (PDGF-BB), Placental Growth Factor (PIGF), VEGF) を定量した。レーザースキャナーSureScan 4900DAにより抗体アレイの蛍光スキャンイメージを取得し、Image Jを用いた解析で10種類の血管新生因子の濃度を定量した。

３．結果と考察（Results and Discussion）
抗体アレイによる血管新生因子10種類の定量結果をFig.1に示す。HeLa細胞はVEGFをわずかに分泌し、その他9種類の血管新生因子は全く分泌しないことがわかった。293FT細胞は血管新生因子をほとんど分泌しなかった。HEK293細胞はPIGFを数ng/mL程度分泌し、わずかなbFGFとVEGFを分泌した。また、温度応答性培養皿を用いて細胞シートを回収および積層化することができたのはHEK293細胞とHeLa細胞であった。以上のことから、HeLa細胞は、主要な血管新生因子の分泌が少なく、かつ積層化細胞シート組織を作製できるヒト細胞株であり、陰性対照として用いることができるとわかった。

４．その他・特記事項（Others）
装置の使用方法についてNIMS竹村氏および高橋氏よりトレーニングを受けた。

５．論文・学会発表（Publication/Presentation）
なし
６．関連特許（Patent）
なし