課題番号 ：S-15-MS-1064
利用形態 ：機器利用
利用課題名（日本語） ：核内受容体と低分子の相互作用に関する研究
Program Title (English) ：Studies on the Interaction between Nuclear Receptors and Small Molecules
利用者名（日本語） ：加来田博貴1), 山田翔也1), 常盤広明2) ,中野祥吾3)
Username (English) ：H. Kakuta1), S. Yamada1), H. Tokiwa2), S. Nakano3)
所属名（日本語） ：1) 岡山大学大学院医歯薬学総合研究科, 2) 立教大学理学部, 3)静岡県立大学
食品栄養科学部
Affiliation (English) ：1) Okayama University Graduate School of Medicine, Dentistry, and
Pharmaceutical Sciences, 2) Faculty of Science, Saint Paul’s University,
3) School of Food and Nutritional Sciences, University of Shizuoka

１．概要（Summary ）
核内に存在し低分子の結合に応じて遺伝子発現を制御する受容体は核内受容体と呼ばれ，医薬分子や環境ホルモンの標的分子として研究されている．核内受容体はリガンドの結合に応じて立体構造を変え，コファクターと呼ばれる他のタンパク質の結合を制御する．本研究では，申請者らによって創出された低分子と核内受容体の一つであるレチノイドX受容体（RXR）との相互作用について，等温滴定型熱量測定 (Isothermal Titration Calorimetry；ITC) を用いて結合能について解析した．
２．実験（Experimental）
受容体タンパク質は，静岡県立大学にて調整したRXR-LBD（原液濃度　141 µM）を用いた．緩衝液として，20 mM HEPES-NaOH (pH 7.5)，150 mM NaCl，1 mM EDTA，5 mM DTT，1% DMSOを用いた．化合物は，岡山大学で合成したRXRアゴニスト09SY11-96を用いた．実験機器は，共同利用機器である等温滴定型熱量測定（Isothermal Titration Calorimetry；ITC）は，Microcal iTC200（Malvern）を用いた．最終結果を得た測定条件は，下記の通りである．[Sample cell] 50 µM RXRa-LBD (in 20 mM Hepes (pH 7.5), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 5 mM DTT, 5% DMSO). [Titrant] 500 µM 09SY11-96 (Coumarin agonist) (in 20 mM Hepes (pH 7.5), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 5 mM DTT, 5% DMSO)．[Conditions] Total # Injections, 19; Cell Temperature, 25℃; Reference Power, 5 µcal/sec; Initial Delay, 60 sec; Syringe Concentration, 0.5 mM, Cell concentration: 0.05 mM, Feedback Mode/Gain: High. [Injection Volume] #1, 0.4 µL; #2–19, 2 µL, [Duration] #1, 0.8 sec; #2–19, 2 sec. [Spacing] 90 sec. [Filter Period] 5 sec.
３．結果と考察（Results and Discussion）
緩衝液中のDMSO濃度を1%として，Sample cell中のRXR-LBD濃度を50 µM，Titrant側のRXRアゴニスト09SY11-96濃度を500 µMで行ったところ，RXRアゴニストの会合に起因すると思われる吸熱現象が観測された．DMSO濃度を5%とすることで，RXRアゴニストの会合が抑制できた．得られたサームグラムは電圧に起因するとみられるベースラインのドリフトが見られたことから，その補正を行った後コントロールで生じる熱量の補正を行った．カーブフィッティングの結果，下記のパラメーターが得られた．n = 1.05 ± 0.116, Ka = 156,000 ± 30,000 M-1, ΔH = -2,400 ± 422 cal/mol, ΔS = 15.6 ± 1.78 cal/mol/deg
４．その他・特記事項（Others）
今回初めてITCを用いた実験を行わせていただいたため，サンプル調整などの情報が足りず， ベースラインのドリフトの原因にもなりうるDTT（還元剤）を含む緩衝液を用いてしまった．この点を反省し，再実験を行う予定である．なお，本実験を行う上で，牧田誠二様，長尾春代様の技術支援を受けました．心からお礼申し上げます．
５．論文・学会発表（Publication/Presentation）
「なし」
６．関連特許（Patent）
RXRアゴニスト09SY11-96（特願2015–237017）．