課題番号                ：S-20-NM-0024

利用形態               ：機器利用

利用課題名（日本語）    ：糸状菌の環境応答機構の解明

Program Title (English) ：Proteomic responses of filamentous fungi to environmental cues.

利用者名（日本語）      ：桝尾俊介

Username (English)     ：S. Masuo

所属名（日本語）        ：筑波大学生命環境系

Affiliation (English)  ：University of Tsukuba, Faculty of Life and Environmental Sciences

１．概要（Summary）

糸状菌（かび）は土壌、動植物の体内など様々な環境に適応し生育範囲を拡大させる。マクロファージは一酸化窒素（NO）を生産することで、生体内に侵入した異物を除去することが知られるが、病原性のものを含む多くのカビはNOに耐性を示す。我々は、モデルカビAspergillus nidulansが有する様々なNO耐性機構を明らかとしてきた。しかしながら、カビにはこれ以外の未知の耐性機構が存在すると考えられている。近年、我々はA. nidulansのNO耐性に、解糖系酵素グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼが関与すること、その活性がNOに耐性を示すことを見出した。本研究では、その耐性化メカニズムを明らかとするため、LCMSを用いて当該酵素のS-ニトロシル化部位の特定を行った。

２．実験（Experimental）

【利用した主な装置】

• LC-MS(Q-Exactive)　装置

【実験方法】

グリセロアルデヒ-3-リン酸デヒドロゲナーゼの大腸菌発現用プラスミドを作製し、大腸菌BL21(DE3)に導入した。得られた株をIPTG存在下で培養し、Histrap-FF crudeカラム(Cytiva)を用いて組換え酵素を精製した。これに様々な濃度のNOドナーを添加し、iodoTMT試薬　（Thermo　Scientific）を用いてS-ニトロシル化システインの特異的標識を行った。トリプシン処理後のペプチドをアセトン沈殿により回収し、C18チップを用いて脱塩・精製した。得られたサンプルをLC-MS/MSに供した。nano-LC の分離カラムはZaplous column Pep-C18, 3um, 120Å, 0.1×150 mmを用いた。Maxquant1.6.17.0を用いてS-ニトロシル化部位の特定を行った。

３．結果と考察（Results and Discussion）

S-NitrosoglutathioneをNOドナーとして用いたサンプルにて、システイン残基のS-ニトロシル化が確認された。本酵素は複数のシステイン残基を有するが、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ活性が維持される低濃度のS-Nitrosoglutathioneを添加した場合では、活性に関与しないシステイン残基はS-ニトロシル化されるものの、活性中心のシステイン残基はS-ニトロシル化されていないことが明らかとなった。活性中心のシステイン残基は、他のものに比べS-ニトロシル化されづらいと考えられ、これが本酵素のNO耐性に寄与すると予想された。

４．その他・特記事項（Others）

本研究はJST ERATO 野村集団微生物制御プロジェクトの一環として行われた。技術支援者：箕輪貴司、竹村太郎、服部晋也

５．論文・学会発表（Publication/Presentation）

(1) 門岡千尋, 鈴木康太, 桝尾俊介, 高谷直樹：Aspergillus nidulansにおける一酸化窒素ストレス誘導型グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼGpdCの機能解析, 日本農芸化学会2021年度大会, 2021, 03, 28

６．関連特許（Patent）

なし。