課題番号 ：S-16-NM-0117
利用形態 ：技術補助
利用課題名（日本語） ：Pin1とリン酸化ペプチドの相互作用解析
Program Title (English) ：Analysis of interaction between Pin1 and phosphorylated-peptides.
利用者名（日本語） ：日高將文
Username (English) ：Masafumi Hidaka
所属名（日本語） ：東北大学大学院農学研究科応用生命科学専攻
Affiliation (English) ：Department of Molecular and Cell Biology, Graduate School of Agricultural Science, Tohoku University.

１．概要（Summary）
Pin1はリン酸化ペプチドに特異的に作用するが、ペプチドのアミノ酸配列に応じて特異性が異なる。本課題では、癌関連タンパク質・c-Mycの配列を模したリン酸化ペプチドに対して、Pin1との分子間相互作用をBiacoreを用いて測定し、特異性と親和性を定量的に決定することで、Pin1と相互作用する分子に対する基盤を得る。

２．実験（Experimental）
【利用した主な装置】
 表面プラズモン共鳴バイオセンサー
BIACORE-X100

【実験方法】
１．実験に利用したリコンビナントタンパク質は、東北大学で作製し、実験に使用した。
2．ヒスチジンタグを付加した組換えタンパク質・Pin1をリガンドとしてセンサーチップ・Sensor Chip NTAに固定化。
3．アナライトとしてリン酸化ペプチド（8残基、分子量約900）を用い、Pin1との相互作用を解析。
4．ネガティブコントロールとして、3．で用いたリン酸化ペプチドと同じアミノ酸配列を有する非リン酸化ペプチドをアナライトとして測定。
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３．結果と考察 （Results and Discussion）
BIACORE X100の標準プロトコルに従い、ヒスチジンタグを付加したPin1タンパク質をリガンドとして、Sensor Chip NTAに固定化したところ、タンパク質吸着によるシグナルの変化を検出し、固定化に成功した。

アナライトとしてリン酸化ペプチド（8残基、分子量約900）を用い、センサーチップに固定化したPin1との相互作用によるシグナル変化の検出を試みたが、有意な変化は認められなかった。

実験の諸条件を検討するため、リガンドの濃度、アナライトの濃度を様々に変化させ測定したが、Pin1とリン酸化ペプチドの相互作用に由来するシグナルの変化は検出されなかった。

今回、相互作用のシグナルが検出されなかった理由として、ペプチドの分子量が小さく、Pin1との相互作用形成によるリガンドの分子量変化が小さかったためであると考えられる。

４．その他・特記事項（Others）
支援者：李香蘭
支援内容：装置操作説明、実験操作、結果解釈についてのディスカッション
科研費：基盤研究（A）Pin1関連分子群を利用した加齢疾患の予防・診断・創薬（研究代表者：内田隆史）
共同研究者：内田隆史

５．論文・学会発表（Publication/Presentation）
なし

６．関連特許（Patent）
なし