課題番号 ：S-17-NM-0098
利用形態 ：共同研究
利用課題名（日本語） ：ラット神経幹細胞由来分化ニューロンのTDP43細胞質凝集体形成に関する研究Program Title (English) ：Formation of TDP-43 aggregates in neural stem cell-derived neuronal cultures
利用者名（日本語） ：渡部和彦
Username (English) ：Kazuhiko Watabe
所属名（日本語） ：杏林大学保健学部臨床検査技術学科
Affiliation (English) ：Department of Medical Technology, Kyorin University Faculty of Health Sciences

１．概要（Summary）
　ヒト筋萎縮性側索硬化症 (ALS) では運動ニューロンにtransactive response DNA-binding protein 43 (TDP-43) 蛋白からなる細胞質凝集体が出現し細胞死が惹起される。我々はこれまでに，ヒト正常TDP-43とそのC末断片を発現する組換えアデノウイルスをプロテアソーム阻害条件下で培養ニューロンに感染させると、リン酸化TDP-43を含む不溶性の細胞質凝集体が形成され（参考文献1,2）、熱ショック応答のマスター転写制御因子であるheat shock transcription factor 1 (HSF1)組換えウイルスの共感染により、このTDP-43細胞質凝集体形成が抑制されることを見出した（参考文献3）。本研究では，HSF1の下流に位置する候補分子を同定するためにcDNA マイクロアレイ解析による検討を行った。

２．実験（Experimental）
　ヒト正常またはC末断片 (208-414) TDP-43をDsRedとともに発現する組換えアデノウイルス、ヒトheat shock transcription factor 1 (HSF1)をEGFPとともに発現する組換えアデノウイルスをラット神経幹細胞1464R由来ニューロンに共感染させた。感染24 時間後、プロテアソーム阻害剤MG-132を負荷し、細胞質凝集体の形成を観察するとともにtotal RNAを調製した。Agilent SurePrint G3 Rat GE Microarray 8x60K Ver. 2.0 (G4858A#074036)を用いたcDNA マイクロアレイにより各実験群間の遺伝子発現を解析し、プローブ毎にシグナル強度を集計、EGFP、TDP-43、HSF1の有無による発現比を求めた。

３．結果と考察（Results and Discussion）
　EGFPウイルスに比べてHSF1EGFPウイルスで2倍以上に発現が上昇する遺伝子は64個、2分の1以下に減少する遺伝子は15個同定された。一方、TDP-43ウイルス感染、MG-132存在下でEGFPウイルスに比べてHSF1EGFPウイルスで2倍以上に発現が上昇する遺伝子は393個、2分の1以下に減少する遺伝子は359個同定された。現在、これら候補遺伝子について順次発現解析を行っている。HSF1の下流に位置するTDP-43凝集体抑制因子を同定することによりALSの新規治療法の開発に繋げていきたい。

４．その他・特記事項（Others）
参考文献
1. Watabe K, et al. Adenoviral expression of TDP-43 and FUS genes and shRNAs for protein degradation pathways in rodent motoneurons in vitro and in vivo. Neuropathology 2014;34:83-98.
2. Ishii T, et al. Formation and spreading of TDP-43 aggregates in cultured neuronal and glial cells demonstrated by time-lapse imaging. PLoS One 2017;12(6):e0179375.
3. Watabe K, et al. Heat shock response suppresses adenovirus-induced TDP-43 aggregate formation in cultured neuronal cells. XXIII World Congress of Neurology, Kyoto, September 19, 2017.
支援者
NIMS　竹村様、森田様にマイクロアレイ解析の支援を受けた。
５．論文・学会発表（Publication/Presentation）
なし。
６．関連特許（Patent）
なし。