課題番号 ：S-18-CT-0112
利用形態 ：共同研究
利用課題名（日本語） ：嫌気性アンモニウム酸化(anammox)細菌におけるヒドラジンN2H4分子の細胞イメージング
Program Title (English) ：in-vivo imaging of N2H4 synthesis in bacterial cells using a specific fluorescence probe
利用者名（日本語） ：押木守,山田耕史朗
Username (English) ：M.Oshiki, K. Yamada
所属名（日本語） ：長岡工業高等専門学校 環境都市工学科
Affiliation (English) ：Department of Civil Engineering, National Institute of Technology, Nagaoka College

１．概要（Summary ）
嫌気性アンモニウム酸化(anammox)細菌はanammox反応の過程でヒドラジン(N2H4)を中間代謝物として合成するバクテリアである。N2H4合成はanammox細菌でのみ見いだされるユニークな代謝能であり、anammox細菌はanammoxosomeと呼ばれる細胞器官においてN2H4合成を行っていると予想されているが、細胞内におけるN2H4の局在性は未解明である。2018年、Tiensomjitrら1)はヒドラジンと特異的に結合する蛍光プローブ(rhodol levulinate probe, 以下、RL)を開発し、細胞内のN2H4イメージングに成功したことを報告している。RLを用いた細胞イメージングを行うことによって、anammox細菌細胞内でのN2H4の局在性を解明できることが期待できることから、1) RLの合成、2) anammox細菌におけるN2H4イメージングを実施した。

２．実験（Experimental）
Tiensomjitrら1)が報告する合成スキームに基づきRLを合成した。合成したRLの純度および構造はNMRにより検証した。有機合成および純度検定は実施機関である千歳科学技術大学大越教授らの研究チームへ依頼し、RL標品を得た。N2H4イメージングでは、anammox細菌であるCandidatus Kuenenia stuttgartiensis培養液にRLを投与し、培養後、細胞を蛍光顕微鏡観察した。

３．結果と考察（Results and Discussion）
既往の報告に基づきRLを合成し、NMRにより純度および構造の検証を行った結果、RL標品が正しく得られたことを確認した。続いて、RLを用いて、K. stuttgartiensisの細胞イメージングを行ったところ、anammox活性を持つバイオマスからRLの蛍光を観察することができた。一方、ネガティブコントロールとして用意した加熱処理によって殺菌したバイオマスからもRL由来の蛍光が観察された。Tiensomjitrら1)の報告によれば、RLはN2H4と特異的に反応し、その他の窒素化合物との反応性は無いとされている。しかし、我々が検証したところ、N2H4合成の基質として培地へ添加したヒドロキシルアミン(NH2OH)とRLが反応し、強い蛍光を呈していることがUV-VISおよび蛍光分光分析によって明らかになった。従って、RL分子はN2H4に対する特異的な蛍光プローブではなく、NH2OHとも反応することが本研究において明らかとなった。この特徴より、当初目的としていたN2H4の細胞イメージングの目的でRLが使用できないことが明らかとなり、RLの別用途での利用（溶液中N2H4/NH2OH濃度の定量）を検討し、研究を現在進めている最中である。

４． その他・特記事項（Others）
参考文献
1) Tiensomjitr, K. et al., (2018) A chromogenic and fluorogenic rhodol-based chemosensor for hydrazine detection and its application in live cell bioimaging. Spetrochim. Acta A 195, 136-141.
謝辞: 本課題はH３０年度千歳科学技術大学ナノテクノロジー支援事業 試行的利用の採択を受け実施した。

５．論文・学会発表（Publication/Presentation）
(1) なし。
６．関連特許（Patent）
(1) なし。