課題番号 ：S-19-NM-0004
利用形態 ：機器利用
利用課題名（日本語） ：リプログラミングにおけるエピジェネティック制御機構の解析
Program Title (English) ：Epigenetic regulation in retrovirus silencing during reprogramming
利用者名（日本語） ：西村　健
Username (English) ：Ken Nishimura
所属名（日本語） ：筑波大学医学医療系
Affiliation (English) ：University of Tsukuba, Faculty of Medicine

１．概要（Summary ）
iPS細胞誘導時には、多能性維持・誘導に関係する遺伝子の発現が、様々なエピジェネティックな制御機構によって上昇する。我々は、多能性維持・誘導に関わる遺伝子のうち、Nanog遺伝子の発現誘導機構を解析するために、ES細胞においてNanog遺伝子のプロモーター領域に結合しているタンパク質の同定を試みた。そのために、特定のDNAに結合しているタンパク質やDNA、RNAの分離が可能な、CAPTURE system (Liu et al. Cell, 2017)を利用する。このsystemでは、解析対象となるゲノムDNAの近傍に結合するガイドRNAを設計し、ガイドRNAとdCas9タンパク質を細胞に導入する。そして、cross-link後にdCas9タンパク質を回収することにより、標的とするゲノムDNAに結合するタンパク質を分離することを可能にする。
そこでまず、Nanog遺伝子プロモーター領域に対して、ガイドRNAをデザインする。そして、そのガイドRNAを用いて、CAPTURE systemで、ES細胞のNanog遺伝子プロモーター近辺に結合するタンパク質を回収した。得られたタンパク質を同定するために、LC/MS/MSを用いた質量分析を行った。

２．実験（Experimental）
タンパク質複合体に対して、DTTによる還元処理、IAAによるシステインのカルバミドメチル化を行なった後に、Trypsin切断を行った。そして、断片化されたペプチドをC-TIPを用いて精製し、最終的にTFA_Aに溶解させた。次に、精製したペプチド断片を、分子・物質合成プラットフォームのLC/MS/MS機（LC: Nano-Advance (BRUKER), MS: Q Exactive Plus (Thermo)）を用いて質量分析した。得られたスペクトルの解析には、Mascot server (MATRIX Science)を用いた。

３．結果と考察（Results and Discussion）
質量分析の結果、ES細胞に対して、Nanog遺伝子プロモーターに結合するガイドRNAを用いたサンプルから、541個のタンパク質が同定された。それに対し、ガイドRNAを加えないサンプルからは427個、線維芽細胞のサンプルからは121個のタンパク質が同定された。これらの同定されたタンパク質を比較することによって、Nanog遺伝子プロモーターに結合すると考えられる候補タンパク質を数十個同定した。
その後、いくつかの候補タンパク質に対して、shRNAによる発現抑制をES細胞で行ったところ、現在までにES細胞の多能性、分化能に変化が起きるタンパク質をいくつか同定している。

４．その他・特記事項（Others）
LC/MS/MS機器の使用や前処理、データの解析について技術指導して頂きました、分子・物質合成プラットフォームの服部晋也様には大変お世話になりました。この場を借りて厚く御礼申し上げます。

５．論文・学会発表（Publication/Presentation）
Bui PL, Nishimura K, M Gonsalo S, Kumar BA, Aizawa S, Murano K, Nagata K, Hayashi Y, Fukuda A, Onuma Y, Ito Y, Nakanishi M, Hisatake K; Template Activating Factor-I Regulates Retroviral Silencing during Reprogramming. Cell Rep., Vol.29(7), 1909-1922, 2019

６．関連特許（Patent）
なし