課題番号 ：S-18-NM-0045
利用形態 ： 機器利用
利用課題名（日本語） ： 低温培養条件において変化する神経幹細胞株(MEB5)の糖タンパク質の網羅的かつ定量的解析
Program Title (English) ： Comprehensive and quantitative analysis of glycoproteins in neural stem cell (MEB5) under hypothermia culture condition
利用者名（日本語） ：古畑　晋 1), 鈴木　佑典1)
Username (English) ：S. Furuhata1), Y Suzuki1)
所属名（日本語） ：1) 日本大学大学院理工学研究科物質応用化学専攻
Affiliation (English) ：1) College of Science and Technology, Nihon University

１．概要（Summary ）
先行研究において，低温下で培養した神経幹細胞株(MEB5)の糖タンパク質糖鎖構造が大きく変化することを明らかにしているが，定量的な解析結果が得られていなかった．それ故，糖タンパク質由来のペプチドのiTRAQ試薬を用いた同位体修飾および精製を行った後に液体クロマトグラフィーと質量分析装置システムを組み合わせたLC-MS/MS(Orbitrap, S-NM-046)による各条件の網羅的プロテオーム解析を検討している．しかしながら，精製後のサンプル溶液は粘度が高く，4℃で静置後，数日で結晶化物が確認されており，上記の分析システムには適していないことがわかった．それ故，本実験では，iTRAQ試薬によるカップリング前後の工程における脱塩操作を行い，結晶化物の除去についての検討を行った．
２．実験（Experimental）
MEB5細胞を通常条件(37℃)または低温条件(32℃)，及びEGF存在下(+)または非存在下(-)の4条件で24時間培養し，総タンパク質を抽出した．その後，3-アミノフェニルボロン酸アガロースを用いて糖タンパク質を精製した．続いて，還元アルキル化，トリプシン消化後，iTRAQ試薬によるカップリングおよび付属のカラムによる精製後，さらにZipTip μC18による脱塩処理を行い，結晶化物の除去について確認を行い，溶液中の結晶化物が取り除かれていることを確認した．
３．結果と考察（Results and Discussion）
　糖タンパク質に精製およびトリプシン消化後の試料を脱塩操作なくiTRAQ試薬を用いたカップリングおよび付属のカラムによる精製を行った後の試料では，4℃で2日間静置後，図1Aに示したように結晶化物が確認された．次に，トリプシン消化後にZipTip μC18による脱塩後では，少し結晶化物が減少したものの，多くの結晶化物が溶液中に確認されていた(図1B)．さらにトリプシン消化後およびiTRAQ試薬によるカップリング後の両工程においてZipTip μC18による脱塩操作を行ったところ，試料中から完全に結晶化物が取り除かれ，溶液の粘性も大幅に低下することがわかった（図1C）．以上の結果から，本実験における糖タンパク質由来ペプチドのiTRAQ試薬のカップリング操作においては，複数回のZipTip μC18による脱塩操作が必要であると考えられた．今後は得られた試料を用いて，網羅的かつ定量的な（グライコ）プロテオーム解析を進めていく予定である．

図1．iTRAQ試薬を用いてカップリング後の溶液中の (A) 脱塩操作なし，(B) トリプシン消化後にのみZipTip μC18による脱塩処理，(C) トリプシン消化後およびiTRAQ試薬によるカップリング後にZipTip μC18による脱塩処理後の位相差顕微鏡画像．
４．その他・特記事項（Others）
本研究の遂行にあたり，技術指導して頂きましたNIMS分子・物質合成プラットフォームの箕輪貴司博士，竹村太郎博士，服部晋也博士に感謝いたします．
５．論文・学会発表（Publication/Presentation）
(1) S. Furuhata, et al., The Ninth international conference on Science and Engineering 2018 (ICSE2018), Yangon (presentation).
６．関連特許（Patent）
なし。