課題番号 ：S-16-MS-1045（前期）、S-16-MS-1045b（後期）
利用形態 ：機器利用
利用課題名（日本語） ：前期，鉄硫黄クラスターの酸化還元状態による[NiFe]ヒドロゲナーゼ活性制御
後期，EPR分光法による[NiFe]ヒドロゲナーゼの鉄硫黄クラスターの酸化還元状態の評価
利用者名（日本語） ：太　虎林
Username (English) ：H. Tai
所属名（日本語） ：奈良先端科学技術大学院大学，物質創成科学研究科
Affiliation (English) ：Nara Institute of Science and Technology, Graduate School of Materials Science

１．概要（Summary ）
[NiFe]ヒドロゲナーゼは，水素分子の分解/合成を触媒する酵素である．私は「ナノテクノロジープラットフォーム」の研究支援を受けて（H26年度），レーザー光照射により生じるNi-L（Ni-L2）状態が，触媒反応中のNi-C状態とNi-SIa状態間の状態遷移の中間体であることを突き止めた．本研究では，EPRとFT-IRを用いて，活性部位Niに末端配位しているシステイン配位子（Cys546）が脱プロトン化されたと考えられるNi-L3状態の検出に成功した．

２．実験（Experimental）
電子常磁性共鳴分光装置（Bruker E-500）
測定温度：3.8－150 K

３．結果と考察（Results and Discussion）
[NiFe]ヒドロゲナーゼのNi-LにはNiの配位環境が僅かに異なる3つの状態（Ni-L1, Ni-L2, Ni-L3）が存在することが報告されているが，それらの違いは不明であった．本研究では，塩基性条件下でNi-L3状態をEPRにより検出することに成功し，Ni-L2からNi-L3への遷移過程ではCys546配位子の側鎖の脱プロトン化が関与していることを提唱した．光照射時と照射前のEPRの差スペクトルから，弱塩基性条件下（274 KでpH 8.0）で，Ni-C（gx = 2.198, gy = 2.144, gz = 2.010）からNi-L2（gx = 2.300, gy = 2.120, gz = 2.049）への光反応性が観測された．一方，塩基性条件下（274 KでpH 9.6）では，Ni-L2以外にもgx = 2.321に新しいシグナルが観測された（gyとgzのシグナルはNi-L2のシグナルと重なっていた）．新しいシグナルは，30 Kで報告されている不安定な状態のNi-L1のg値（gx = 2.26, gy = 2.11, gz = 2.05）と異なるg値を示し，Ni-L2より大きいgx値を示したことから，Ni-L3に帰属した．Ni-L2とNi-L3の違いを明らかにするため，活性部位Feに結合してしるCO伸縮振動（νCO）をFT-IRにより求めたところ，Ni-L3のνCOバンドはNi-L2に比べて20 cm-1低波数シフトしており，[NiFe]ヒドロゲナーゼの各種状態のνCOバンドの中で最も低波数に観測された． Ni-Cへの光照射で生じるNi-L2では，Ni-Fe間に架橋していたH−がH+ として放出され，Cys546配位子の硫黄に結合することが報告されており，Ni-L3はCys546の脱プロトン化状態であることが示唆された．チオレートはチオールより強いσドナーであるため，Niに配位している硫黄が脱プロトン化するとNiの電子密度が上昇すると推測される．Niの電子密度の上昇により，Ni−Feの金属−金属結合を通じてFeの電子密度が上昇するから，Ni-L3ではNi-L2に比べてνCOバンドが20 cm-1低波数シフトしたと考えられる．さらに，Ni-L2とNi-L3からNi-SIaへの変換の祭，１個の電子がNi-Fe活性部位から放出されるが，近位[Fe4S4]p2+/+クラスターが酸化型の時だけ電子を受け取ることができ、Ni-L2とNi-L3からNi-SIaへの変換が行われることもEPRにより明らかになった．

４．その他・特記事項（Others）
無し

５．論文・学会発表（Publication/Presentation）
(1) 太虎林，西川幸志，井上誠也，樋口芳樹，廣田俊，第16回日本蛋白質科学会年会，平成28年6月７日.
(2) S. Hirota, H. Tai, K. Nishikawa, S. Inoue, and Y. Higuchi, 11th International Hydrogenase Conference (Hydrogenase 2016), 2016/7/11.
(3) Y. Higuchi, N. D. M. Noor, H. Matsuura, K. Nishikawa, H. Nishihara, K-S. Yoon, S. Ogo, H. Tai, S. Hirota, and Y. Shomura, 11th International Hydrogenase Conference (Hydrogenase 2016), 2016/7/13.
(4) 許力揚，太虎林，井上誠也，西川幸志，樋口芳樹，廣田俊，第10回バイオ関連化学シンポジウム，平成28年9月7日
(5) 太虎林，許力揚，井上誠也，西川幸志，樋口芳樹，廣田俊，第54回日本生物物理学会年会，平成28年11月25日
(6) 太虎林，許力揚，西川幸志，樋口芳樹，廣田俊，日本化学会第97春季年会（2017），平成28年3月16日

６．関連特許（Patent）
無し