課題番号 ：S-16-JI-0004
利用形態 ：技術代行
利用課題名（日本語） ：機能性高分子によるバイオミメティック材料の開発
Program Title (English) ：Development of Functional Polymer with Biomimetic Method
利用者名（日本語） ：三浦佳子
Username (English) ：　Yoshiko Miura
所属名（日本語） ：九州大学大学院工学研究院
Affiliation (English) ： Graduate School of Engineering, Kyushu University

１．概要（Summary ）
細胞の表面には種々のリガンドがあり、細胞の外にある生体物質（タンパク質、ウイルス、他の細胞）などと特異的に相互作用している。このような相互作用を人工的に利用することで、バイオセンサーや分離材料を創製することができる。そこで、本年度研究では、特に細菌類の接着を防ぐような高分子を結合させて、基板に対するタンパク質、細菌類の結合の様子を調べた。基板に対して、高分子をグラフト化した上で、この高分子の修飾について、X線分光解析を中心とした手法によって解析した。また、解析を行った基材に対する、生体機能を検討した。

２．実験（Experimental）
基材としてはヒドロキシアパタイトのタブレット（Hoya、Tokyo）, ヒドロキシアパタイト粉末（シグマアルドリッチ、USA）を用いた。これらのヒドロキシアパタイトを修飾する高分子として、PEGMAとリン酸を持つメタクリレートの共重合体を用いた（Figure1）.ポリマーの水溶液を10mg/mLに調製して、この溶液に、アパタイトを浸漬した。得られた基材について、X線分光解析装置（Kratos AXIS－ULTRA DLD）によって測定した（村上技官による技術代行を利用）。解析は、Peak Fitソフトを用いた。
得られた修飾アパタイトに対する、生体分子の作用を調べた。生体分子としては、タンパク質(りぞチーム、牛血清アルブミン)、ブドウ球菌の接着を調べた。ブドウ球菌の接着については、走査型電子顕微鏡(SEM)(SU8000, 日立ハイテクノロジー)によって、数を計測することで行った。

Figure1　アパタイト修飾用ポリマーの構造式
３．結果と考察（Results and Discussion）
アパタイトに対する糖鎖高分子の修飾はC(1s)スペクトルを中心に解析を行った。未修飾の基板では、C(1s)には殆どピークが出現していなかったにもかかわらず、ポリマー浸漬後は強いピークが観測された。また、修飾した後の基材をバッファーに浸漬しておいてもC(1s)ピークは減少しなかったことから、ポリマーの結合は強固で、修飾は安定であることがわかった。また、時間を変えてこの修飾の様子を観察したところ、30分程度の短時間でも、ポリマーの修飾は終了することがわかった。すなわち、リン酸を持つ高分子のアパタイトへの修飾は強固であり、かつ短時間に起こることがわかった。

Figure 2 アパタイトおよびアパタイト修飾基材のXPS解析の結果。(a) 未修飾基板、(b)ポリマー修飾後の基板、(c)ポリマー修飾後PBSに2.5時間浸漬した後の基板。

ポリマーの結合は、コポリマーのリン酸部分のCa部分へのキレートが重要であると考えられる。リン酸部分がない場合にも短時間であれば、ポリマーの修飾が観察されるが、バッファー中での洗浄での剥離が極めて早かった。
一方で、ポリマーの修飾を行うとリン酸基が固定されることによって、ゼータ電位が著しく変化してポリマーの固定によって、表面が負になった。この性質はタンパク質の結合に著しく影響を与えて、BSAが修飾アパタイトに殆ど結合しないのに対して、正電荷を持つタンパク質であるリゾチームはリン酸ポリマー修飾アパタイト表面には顕著に結合した。タンパク質の結合忌避活性効果については、PEGの量よりも、タンパク質と基材の正電相互作用が最も強い影響を及ぼした。

Figure 3 PEGとリン酸側鎖の割合を変えて合成したポリマーによるアパタイト修飾基材のタンパク質の吸着量の変化。(a) BSA, (b)リゾチーム

得られた基材について、ブドウ球菌の接着を調べた。バイオフィルムモデルとして、BSA, リゾチーム、デキストランを加えた条件下で検討を行った。

Figure 3 ブドウ球菌（108 CFU/mL）の接着数の観察(a) 添加物なし、(b)BSA添加、(c)リゾチーム添加、(d) デキストラン添加
PEGとリン酸の割合がともに高い、PEG0.5ポリマーは特に菌の接着を顕著に防ぐことがわかった。いかなるバイオフィルムモデルの場合も顕著な最近接着忌避活性効果を示した。

４．その他・特記事項（Others）
科研費挑戦的萌芽(16K14007), 基盤B(15H03818), 新学術領域精密反応場（16H01036）の支援を受けて行った。

５．論文・学会発表（Publication/Presentation）
論文発表
(1) Nagao, M., Kurebayashi, Y., Seto, H., Tanaka, T., Takahashi, T., Suzuki, T., Hoshino, Y., Miura, Y.”Synthesis of well-controlled glycopolymers bearing oligosaccharides and their interactions with influenza viruses”, Polymer J, (2016) 48, 745–749.
(2) Seto, H., Imai, K., Hoshino, Y., Miura, Y., “Polymer microgel particles as basic catalysts for Knoevenagel condensation in water”, Polymer J, (2016) 48, 897–904.
(3) Miura, Y., Fukuda, T., Seto, H., Hoshino, Y. “Development of glycosaminoglycan mimetics using glycopolymers”, Polymer J, (2016) 48, 229–237.
(4) Cui, X., Koujima, Y.,Seto, H., Murakami, T., Hoshino, Y., Miura, Y., “Inhibition of Bacterial Adhesion on Hydroxyapatite Model Teeth by Surface Modification with PEGMA-Phosmer Copolymers”, ACS Biomater. Sci. Eng., (2016) 2, 205–212.

学会発表
(1) 松本光、秋吉孝則、瀬戸弘一、星野友、三浦佳子、“サイズ制御されたゲルネットワークの流通式触媒反応への応用” 第82回化学工学年会, 2017年3月
(2) 秋吉孝則、松本光、瀬戸弘一、星野友、三浦佳子、“高活性および長寿命をもつPd担時ナノゲルの設計”第82回化学工学年会, 2017年3月
(3) 松本光、瀬戸弘一、星野友、三浦佳子、“高分子ゲルモノリスによるフロー化学プロセスの開発”, 第82回化学工学年会, 2017年3月
(4) 田口裕貴、寺田　侑平、星野友、三浦佳子、“糖鎖高分子ブラシを用いたバイオインターフェースの開発” 第19回化学工学会学生発表会, 2017年3月
(5) Yoshiko Miura, Porous　Glycopolymer Monolith for Protein Separation, Ewha Chemistry and Nanoscience International Symposium (ECNIS) 2016年10月
(6) 秋吉 孝則, 瀬戸 弘一, 星野 友, 三浦 佳子, “Pdナノ粒子触媒の活性および寿命を向上させるナノゲル担体の設計”, 化学工学会 第48回秋季大会, 2016年９月

６．関連特許（Patent）
なし