課題番号 ：S-16-NM-0109
利用形態 ：共同研究
利用課題名（日本語） ：睡眠中の記憶固定化の分子メカニズム
Program Title (English) ：Molecular mechanisms of memory consolidation during sleep
利用者名（日本語） ：坂口昌徳
Username (English) ：Masanori Sakaguchi
所属名（日本語） ：筑波大学国際統合睡眠医科学研究機構
Affiliation (English) ：Univ. Tsukuba, WPI-IIIS

１．概要（Summary）
ヒトを含む成体海馬の歯状回(Dentate Gyrus,DG)では神経幹細胞からニューロンの新生が生涯続く1。高い記憶容量とより複雑な睡眠状態を進化させてきた哺乳類では、DGの構造が非常に発達している2。 我々は、光遺伝学を用いて、DGの新生ニューロンの活動が睡眠ステージに依存する記憶の固定化に重要であることを見出した(Kumar et al., in preparation)。　睡眠に依存する記憶形成の責任分子を同定するため、筆者らは遺伝学的および非遺伝学的両方の手法を試みている。遺伝学的な手法としてマイクロアレイを利用した解析をするため、サンプルの調整法と必要量を検討したが、必要なRNA量を抽出することができなかったので、今後更なる条件検討が必要である。

２．実験（Experimental）
【利用した主な装置】
 Laser Micro Dissection (Leica LMD7000)

【実験方法】
筆者らは3つの要素、すなわち睡眠ステージ(i.e., rapid eye movement (REM), non-REM, Awake)と記憶(i.e., learning, no learning)、光操作により制御された新生ニューロンの活動、に依存して歯状回で変動する分子をスクリーニングする。DGサンプルは、これらの要素でマウスを制御し脳を取り出し凍結させた後、Cryostat(Leica CM1860 UV)で切り出しヘマトキシリン染色した切片を作成し、さらにLMDを用いてDGのupper blade を回収する。
Fig. 1. (Left) before and (right) after cutting out of the DG structure in a mouse.

３．結果と考察 （Results and Discussion）
まず、サンプルの調整方法と必要な量を決定するために、LMDで取り出したDG upper bladeと大脳基底核からRNA抽出を試みた。総体積はそれぞれ約0.003mm3 と約0.03mm3であった。
ISOGENを用いたRNA抽出の結果、吸光ピークが260nmに確認できず、RNA量が少なく不純物が多いと考えられた。続いてDNaseⅠ処理と精製をすると、不純物は取り除けたがRNA量は少なかった。さらに、精製後の全量を電気泳動ではRNAのバンドが認められなかった。また、祖抽出RNAを直接電気泳動したが、RNAのはっきりとしたバンドは確認できなかった。
現状ではLMDサンプルからマイクロアレイに必要なRNA量を抽出できず、またRNAが分解している可能性がある。今後はRNA分解を防ぎ、必要なRNA量を得るために、サンプルの保管方法や解析する部位の範囲を検討する予定である。

４．その他・特記事項（Others）
参考文献
1. Eriksson, P. S. et al. Neurogenesis in the adult human hippocampus. Nat. Med. 4, 1313–7 (1998).
2. Kempermann, G. New neurons for ‘survival of the fittest’. Nat. Rev. Neurosci. 13, 727–736 (2012).
本研究の遂行にあたり、技術指導等お力添えいただきました竹村太郎先生、箕輪貴司先生に暑く御礼申し上げます。
This work was partially supported by the MEXT World Premier International Research Center Initiative (WPI);MEXT World Premier International Research Center Initiative (WPI); CREST JST; MEXT KAKENHI for Scientific Research on Innovative Areas “Microendophenotype” (25116530) and “Memory Dynamism” (26115502); JSPS KAKENHI grant numbers (16K18359, 15F15408); Research Foundation for Opto-Science and Technology; The Shimadzu Science Foundation; Kato Memorial Bioscience Foundation; Japan Foundation for Applied Enzymology (TMFC); Uehara Memorial Foundation; The 2016 Inamori Research Grants Program; The Ichiro Kanehara Foundation for the Promotion of Medical Sciences and Medical Care; The Life Science Foundation of Japan; Kowa Life Science Foundation Research Grant; GSK Japan Research Grant; and KANAE Foundation for the Promotion of Medical Science

５．論文・学会発表（Publication/Presentation）1. Iyo Koyanagi, Kazuhiro Sonomura, Deependra Kumar, Hirotaka Obo, Takaaki Sato, Takeshi Sakurai, Masanori Sakaguchi, Molecular mechanisms of memory consolidation during sleep, the 40th Annual meeting of the Japan neuroscience society, July 20-23, 2017, Makuhari Messe, Chiba, Japan.

６．関連特許（Patent）