課題番号 ：S-17-KU-0003
利用形態 ：膜タンパク質-脂質分子相互作用分析
Program Title (English) ：Evaluation of Interaction between Membrane Protein and Lipid
利用者名（日本語） ：稲田 壮峰 1), 松森 信明 2)
Username (English) ：M. Inada1), N. Matsumori2)
所属名（日本語） ：1) 九州大学大学院　理学府, 2）九州大学大学院　理学研究院
Affiliation (English) ：1) Department of Chemistry, Graduate School of Science, Kyushu University
2）Department of Chemistry, Faculty of Science, Kyushu University

１．概要（Summary ）
膜タンパク質と脂質の相互作用に対する定量分析法の新規開発の一環として、等温滴定型熱量測定(ITC)を用いて相互作用を解析した。本課題では、膜タンパク質として、高度好塩菌により産生されるバクテリオロドプシン（bR）を用いて、脂質との相互作用を検討した。その結果、人工脂質との相互作用における親和性は、脂質の構造により変化することが確認され、また、新規分析法と傾向が一致した。一方で、高度好塩菌の生体膜から単離した脂質を用いると、親和性が非常に小さく見積もられ、新規分析法の結果とは大きく異なる結果が得られた。これは、脂質との相互作用により生じる、熱の収支を伴うbRの構造変化に起因している。

２．実験（Experimental）
VP-ITC calorimeter (Microcal Inc., Northampton, MA, USA)を用いてbRと脂質の相互作用を検討した。脂質、bRをそれぞれHBS-EP buffer (10 mM HEPES [pH 7.4], 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0.05% (v/v) Tween 20)に溶解し、1.96 mM,0.02 mMの濃度で調製した。（滴定終了時のセル内のbR/lipid比=1/15）
使用サンプルおよびバッファーは測定前に25℃で超音波処理することで脱気した。測定では、脂質溶液 4 uLを50回、3分おきに1412 uL bR溶液に対して滴定した。また、溶液は130 rpmで撹拌し, 25°Cで測定を行った。 また、bRおよび脂質の溶解熱を差し引くため、バッファーに対する脂質の滴定およびbRに対するバッファー滴定も同様の条件で行った。得られたデータはMicrocal Originで解析し、 相互作用の各パラメーターを得た。エンタルピーΔH,解離定数KDは得られた熱量から、エントロピー項–TΔSはΔH–ΔGから計算した。
３．結果と考察（Results and Discussion）
　市販されている人工脂質とbRの相互作用測定では、bRに対する脂質の親和性に対する脂質の疎水性尾部による疎水性相互作用および親水性頭部による静電相互作用の寄与が示唆された。この結果は、新規分析法を通して得られた結果の傾向と一致しており、新規分析法の有用性を示すと解釈される。
　一方で、産生菌生体膜から単離した脂質（PGP-ME,S-TGA-1）とbRの相互作用については、新規分析法と異なり、親和性が非常に弱く示された。これは、脂質との相互作用によりbRに構造変化がもたらされることに起因している。発生熱量から相互作用を評価するITCシステムでは、構造変化に起因する熱量により大きく誤差が生じ、bR-脂質相互作用のみを精確に評価することができなかったと考えられる。

Figure. 1 bR-脂質相互作用における親和性
およびSPR-based分析とITC分析の相関
（論文１の図を一部改変）
４．その他・特記事項（Others）
工学研究院 三浦佳子 教授, 星野友 准教授,工学府 片上将 修士, 谷口昇平 学士にITC使用および解析について大変お世話になりました。厚く御礼申し上げます。

５．論文・学会発表（Publication/Presentation）
論文
1. Inada. M, et al. Quantitative Evaluation of Interactions between Lipids and Membrane Proteins using Surface Plasmon Resonance（in submission）

学会発表
1.○M. Inada, M. Kinoshita, N. Matsumori, Interaction of Glycolipid S-TGA-1 with Bacteriorhodopsin and Its Functional Role, 17th Asian Chemical Congress & 19th General Assembly of FACS, Melbourne, Australia, 2017年7月

2.○M. Inada, M. Kinoshita, N. Matsumori, Function and Structure of Bacteriorhodopsin Are Optimized by Interaction with Glycolipid S-TGA-1, 新学術領域研究「動的秩序と機能」第6回国際シンポジウム、浜松市、2018年１月
他2件

６．関連特許（Patent）
なし。