課題番号 ：S-16-MS-2003
利用形態 ：機器利用
利用課題名（日本語） ：走査型軟X線顕微鏡の生体分子マッピングにおける定量化の検討
Program Title (English) ：Quantitative mapping for biomolecules in biological specimens using STXM
利用者名（日本語） ：伊藤　敦1), 篠原邦夫1), 刀祢重信2), 加道雅孝3), 大東琢治4)
Username (English) ：A. Ito1), K. Shinohara1), S. Tone2), M. Kado3), T. Ohigashi4)
所属名（日本語） ：1)東海大学工学部、2)東京電機大学生命理工学系、3)量研開発機構、4)分子研UVSOR
Affiliation (English) ：1)School of Engineering, Tokai University, 2)Graduate School of Science and Engneering, Tokyo Denki University, 3)Natl. Inst. Quantum and Radiological Sci. Technol., 4)UVSOR Synchrotron, Inst. Molecular Science

１．概要（Summary）
走査型軟X線顕微鏡（STXM）による強力な化学マッピングは生体試料にも適用されてきた。しかし、いずれの研究もC-K吸収端での生体分子のNEXAFSを用いたもので、しかも定性的な分布を求めた報告が多い。われわれは生体を構成する主要元素であるC, N, O-K吸収端でのDNA、タンパク質及び細胞のNEXAFSを取得し、3つの吸収端でのスペクトルを結合して、より高精度の分布解析を試みた。さらに、N-K吸収端にて核酸（DNA及びRNA）とタンパク質のNEXAFSピークが異なることを利用して、核酸とタンパク質量を細胞内の各領域で求め、それらを比較することができた。結果は各領域で核酸とタンパク質量は異なるものの、その比は非常に近いという興味深い知見が得られた。
２．実験（Experimental）
UVSORのBL4Uに設置されたSTXMを用いて、C-K、N-K及びO-K吸収端にて測定を行った。試料は、間期のチャイニーズハムスターCHO細胞を酢酸エタノール固定及びグルタルアルデヒド固定を行ったものを、フォルムバール膜上に滴下し付着させた。DNA、タンパク質（ウシ血清アルブミン、以下BSAと略記）も同様にフォルムバール膜上に水溶液を滴下し試料とした。画像解析及びスペクトル解析にはaXis2000ソフトウェアを利用した。
３．結果と考察（Results and Discussion）
図1にSTXMにより285eVにて取得したCHO細胞を示す。酢酸エタノール固定の場合、核内がより透明となって骨格のみが残されているように見える。図中の領域はNEXAFSを測定した部位である。1は細胞核、2は核小体、3は細胞質、4は細胞外領域を示す。

図1．固定されたCHO細胞とNEXAFSを測定する細胞内領域。(a)酢酸エタノール固定、領域サイズ2.25m角、(b)グルタルアルデヒド固定、領域サイズ0.73m角。
これらの微小領域のDNAに換算した核酸量、タンパク質量をNEXAFSから以下の手順で求めた。N-K吸収端での領域スペクトルでのDNA特異的なピークの大きさを求め、DNAスペクトルをその大きさに補正した。補正されたDNAスペクトルの縦軸ODを質量吸収係数の情報からmass thickness(g/cm2)に換算した。微小領域スペクトルから補正DNAスペクトルを差し引くと、DNA特異的ピークが消える。このスペクトルにおけるタンパク質ピークの大きさを求め、BSAスペクトルを補正し、DNAの場合と同様の手順でタンパク量を求めた。下表に結果を示す。
領域 核酸（g/cm2） タンパク質（g/cm2） DNA/タンパク質
(a) 1 6.71 33.1 0.20
(a) 2 10.3 48.4 0.21
(a) 3 5.5 23.5 0.23
(b) 3 11.1 57.7 0.19
各領域の核酸とタンパク質量は大きく異なるが、その比はほぼ一定であった。
４．その他・特記事項（Others）：
科研費基盤研究(C)（課題番号16K05021）の一部サポートを得ている。
５．論文・学会発表（Publication/Presentation）：
(1) K. Shinohara et al., 13th International Conf. on X-Ray Microscopy (XRM2016), 2016.8.
６．関連特許（Patent）：
なし