課題番号 ：S-16-CT-0091
利用形態 ：機器利用
利用課題名（日本語） ：阻害剤存在下でのアミロイドβ凝集体形態の経時的観察
Program Title (English) ：Observation of time-dependent changes of amyloid-β morphology in the presence of inhibitors
利用者名（日本語） ：田口莉帆, 上井幸司
Username (English) ：R. Taguchi, K. Uwai
所属名（日本語） ：1) 室蘭工業大学大学院工学研究科
Affiliation (English) ：1) Graduate School of Engineering, Muroran Institute of Technology

１．概要（Summary）
カフェイン酸誘導体によるアルツハイマー病の病因の1つとされる脳内でのアミロイドβ(Aβ)の凝集・蓄積阻害のメカニズムを解明するために、我々はこれまでにその効果を経時的にチオフラビン(ThT)法、円二色性分散スペクトルなどにより検討してきた。本研究では、合成した阻害剤存在／非存在下での凝集過程における凝集体・線維の形態の変化をTEMあるいはAFMにより経時的に観察することで、阻害剤が凝集のどの段階を阻害しているのかを検討した。

２．実験（Experimental）
Aβ を 300 µM になるように 6 mM NaOH で溶解した溶液をストック溶液として用いた. カフェイン酸および合成したロスマリン酸誘導体の 0, 2.74, 57.0, 120 µM のAβ溶液 (30 µM Aβ, 1xPBS) を, 30 µLずつ分注した. その後, 37 oC で 24 h 加温し, 測定まで氷冷下保存した. サンプル溶液を支持膜付グリット (エラスチックカーボン ELS-C10 STEM Cu100P グリッド仕様, 応研商事) に 3 min 乗せ,さらに2 % タングステン酸 3 µLを 3 min 乗せ, TEM (H-7600, Hitachi) により測定を行った.

３．結果と考察（Results and Discussion）
ロスマリン酸とカフェイン酸誘導体存在下, Aβ凝集過程での凝集体の形態を TEM により比較検討した.
ThT 法での EC50 値の濃度のロスマリン酸 (2.74 µM) または,カフェイン酸誘導体(57.0 µM) 存在下および, Aβ濃度に対して 4 倍の濃度のロスマリン酸 (120 µM) または, カフェイン酸誘導体(120 µM) 存在下での Aβモノマー溶液の 24 h 後の TEM 画像を測定した.
阻害剤非存在下では,太い線維が, 層状に観察された. これに対してロスマリン酸(2.74 µM)存在下, Aβ凝集体の線維量は減少し,長い線維が観察された. ところが, カフェイン酸誘導体(57.0 µM)存在下, Aβ凝集体は およそ偏平で,比較的短い長さの線維が観察された.
また, Aβ濃度に対して 4 倍の濃度(120 µM)の誘導体を添加したときの TEM 画像には誘導体間で顕著な違いが観察された. ロスマリン酸存在下では,円形の核が観察されたが, 非常に短く小さな線維の集合であると考えられる. ここではコントロールで観察されたような線維は見られなかった. また, 同濃度のカフェイン酸誘導体存在下では,非常に短い線維が観察された. 円形状の核が, カフェイン酸誘導体で観察された短い線維の集合であるとすれば, カフェイン酸誘導体はロスマリン酸よりも Aβ凝集段階の初期を阻害している可能性が示唆された.

４．その他・特記事項（Others）
本実験を行うにあたり、千歳科学技術大学フォトニクス研究所　河野敬一先生、山﨑郁乃技術員には多大なる支援をいただきました。御礼申し上げます。
また、本研究に関する競争的資金として，科学研究費補助金（基盤研究C）「シソ科植物の成分に基づく新規アミロイドβ凝集阻害物質の開発」の援助を受けました。

５．論文・学会発表（Publication/Presentation）
なし

６．関連特許（Patent）
なし