課題番号 ：S-18-NM-0048
利用形態 ：機器利用
利用課題名（日本語） ：脱ユビキチン化酵素TRE17/USP6による膜蛋白質リサイクリング機構の解析
Program Title (English) ：Mechanism of membrane protein recycling mediated by the deubiquitinating enzyme TRE17/USP6
利用者名（日本語） ：小倉由希乃, 船越祐司
Username (English) ：Y. Ogura, Y. Funakoshi
所属名（日本語） ：筑波大学医学医療系／筑波大学大学院人間総合科学研究科　生理化学
Affiliation (English) ：Department of Physiological Chemistry, Faculty of Medicine and Graduate School of Comprehensive Human Sciences

１．概要（Summary ）
受容体や接着因子などの細胞膜タンパク質は、エンドサイトーシスによって細胞内に取り込まれた後、リソソームへと運ばれ分解されるか、細胞膜へとリサイクリングされる。申請者らは、脱ユビキチン化酵素TRE17が、標的膜蛋白質を脱ユビキチン化することにより、リサイクリングを促進することを明らかにしている。このTRE17の機能発現にはTRE17の細胞内局在が重要であるが、TRE17の細胞内局在がどのように制御されているのかは不明である。そこで、TRE17の相互作用因子を同定することにより、TRE17の細胞内局在、およびそれを介したリサイクリング制御メカニズムの解明を目指す。
２．実験（Experimental）
利用機器：LC-MS/MS (Zaprous ADV Q-Exactive system)
実験方法：利用者らは、細胞内局在に異常をきたすTRE17の変異体（TRE17 mt）を作製していることから、TRE17 wtとTRE17 mtそれぞれの相互作用因子を比較し、TRE17 wtにのみ相互作用する因子の同定を試みた。相互作用因子の探索には、近位依存性ビオチン標識（BioID）を用いた。この方法では、目的タンパク質にビオチンリガーゼを融合させることによって、細胞内で相互作用した蛋白質をビオチン化させ、ビオチン化した蛋白質アビジンにより回収した。回収したサンプルを上記LC-MS/MSにて解析した。
３．結果と考察（Results and Discussion）
TRE17 wt特異的に相互作用する因子の候補として、TRE17の標的となり得る膜蛋白質（受容体やトランスポーター等）が同定されたことから、BioIDによる相互作用因子探索の実験系は確立できたと考えられる。膜蛋白質の他に、細胞内膜小胞輸送に関わる因子、翻訳後修飾調節因子等が同定されており、今後、これらの因子とTRE17の相互作用の確認、およびTRE17の局在制御について解析を行っていく。
４．その他・特記事項（Others）
謝辞：機器の使用にあたり、使用法の指導等多大なご支援を賜りました、国立研究開発法人物質・材料研究機構の箕輪貴司先生、竹村太郎先生、服部晋也先生に深く感謝申し上げます。本研究は、日本学術振興会科学研究費助成事業（課題番号17K07327）の支援を受け実施しております。
５．論文・学会発表（Publication/Presentation）
学会発表：○小倉 由希乃、船越 祐司、大林 典彦、金保 安則　脱ユビキチン化酵素TRE17と低分子量G蛋白質Arf6によるクラスリン非依存的カーゴ蛋白質の輸送制御　　第41回日本分子生物学会年会　2018年11月28日 〜 30日　パシフィコ横浜

６．関連特許（Patent）
なし