課題番号 ：S-18-NM-0055
利用形態 ：共同研究
利用課題名（日本語） ：光るコラーゲン発現誘導可能な細胞株の樹立
Program Title (English) ：Establishment of cell lines having inducibility of tagged collagen
利用者名（日本語） ：田中利明1)
Username (English) ：T. Tanaka1)
所属名（日本語） ：1) 東京工業大学生命理工学院
Affiliation (English) ：1) Dep. of Life Sci. and Tech., Tokyo Institute of Technology

１．概要（Summary ）
従前の研究手法ではコラーゲンの生合成過程はほとんど解明されておらず、コラーゲン異常を起因とする疾患は難治性となっている。申請者は、従前法では不可能であったコラーゲン生合成過程を、新技術（光るコラーゲン）の開発により解析可能にした。線維芽細胞や骨芽細胞などコラーゲン分泌細胞への当該技術適用によりコラーゲン生合成過程を解析し、難治性疾患の原因解明に資するデータを得る。この研究遂行に必要となる光るコラーゲン安定細胞株を樹立する。
２．実験（Experimental）
今年度、新たにhuman type I collagen1遺伝子 promoter を単離したことから、光るコラーゲン発現 DNA コンストラクトに対して、これまでの CMV promoter との入れ替えを実施した。この新DNAコンストラクトを用いて、マウス線維芽細胞NIH3T3およびマウス骨芽細胞MC3T3-E1により安定発現細胞株の樹立を試みた。
使用装置：CO2インキュベーター、蛍光位相差顕微鏡、Western Blotting検出器、セルソーター
３．結果と考察（Results and Discussion）
当該新コンストラクトにより、NIH3T3で5株、 MC3T3-E1で4株の安定発現株樹立に成功した。従前のCMV promoter ではNIH3T3の株が樹立できていないことから、新コンストラクトの発現量は細胞にストレスの少ないレベル（内在性に近いレベル）であると予想された。このNIH3T3樹立細胞株を用いてTGF-などへの応答性を調べた結果、因子添加により光るコラーゲンの発現量が増加することを確認した（上図、某社保有の成分Xのコラーゲン生合成に対する効果を調べた例）。また、Western bloting法により、光るコラーゲンの発現量が外部因子に応答して増えていることを確認した。これらの結果により、当初計画通りに、外部因子で発現誘導されるコラーゲン量の変化を、可視化して知ることが可能なアッセイ系を確立した。
４．その他・特記事項（Others）
謝辞：本研究の遂行に関して機器、技術、実験に関する支援を頂いた（株）資生堂 常長誠 博士、NIMS森田浩美 氏、箕輪貴司 博士、東工大 守矢恒司 氏に深く感謝いたします。「光るコラーゲン」プロジェクトについて親身にアドバイス頂いた東工大 生駒俊之 先生並びにNIMS花方信孝 先生に深く感謝いたします。
５．論文・学会発表（Publication/Presentation）
(1)K.Kawaguchi, A.Endo, Y.Madoka, T.Tanaka, M.Komada. Biochemical and Biophysical Research Communications 499 (2018), pp635-641.
(2)田中利明、常長誠、柳川享世、茂呂忠、内山太郎、上田修、田川陽一、稲垣豊、生駒俊之, 第50回日本結合組織学会, 平成30年6月29日.
(3) 守矢恒司、生駒俊之、田中利明、第41回日本分子生物学会年会, 成30年11月30日.
(4) 田中利明、第5回 LiHub フォーラム（主催）,平成30年12月13日.
(5) 田中利明、第9回化粧品開発展アカデミックフォーラム、平成31年1月31日.
６．関連特許（Patent）
(1) 田中利明、生駒俊之、田中順三, 「コラーゲン融合タンパク質、及びそれを用いた薬剤のスクリーニング方法」, WO2016152882 A1, 2016年9月29日.